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成功做出免疫组化Tips-朱智慧 投稿

成功做出免疫组化Tips-朱智慧


导语


在分子生物学领域,要探索某个基因的功能往往需要知道它的时空表达谱(temporal-spatial expression pattern),因此实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和免疫组化染色(immuno-histochemistry staining)往往成为科研人员常用的两种手段。

然而,前者的不稳定性和易受干扰性以及昂贵的试剂耗材使得我们往往不得不借助于后者进行校验,过程虽复杂,但效果惊人。

本人读博期间做过免疫组化无数,自行摸索出了一些小秘方,望广大同僚从中受益。

Tips 1

如何防脱片


由于免疫组化过程烦冗,等完成所有步骤后载玻片上的样本往往损失过半,前期花费不少精力好不容易得到心仪的片子就这样没了使得我们有时倍感懊恼。


市场上虽有商品化的赖氨酸包被(lysine coa-

ted)的载玻片,效果虽较普通载玻片好,但价格是后者的好几倍。这里我就 post一个非常有用的小秘方,廉价且高效:


将纯甘油与新鲜的蛋清在旋涡振荡器上混合(体积1:1)均匀后,所得乳浊液用一定孔隙大小的纱布(四层)过滤,滤液储存于无菌BD管中置于4度就可以备用了。切片前只要在干净的普通载玻片上薄薄涂上一层,待稍加晾干就可以直接贴片了。


这里还要提醒一句在制备的切片最好在50摄氏度的hybridization oven烘干半小时再储存或进行后续的染色。



Tips 2

抗体的选择

如何选择一个高效的抗体在成功做出免疫组化实验中至关重要。如今国内外抗体生产商越来越多,要找出特异性识别某个目的基因的高效抗体实非易事。读研期间,我也买过不少抗体,有80%都成功用于实验:



首先我会在 google 中输入目的基因的名字以及物种,如anti-PCNA, mouse。在检索结果中如已有发表文章中用到该抗体,那就直接记下该产品货号前去购买即可,这是最最保险且简单的途径之一。


如果此法不通,则可在一些综合性生物网站上进行条件性筛选,比如species, application, antigen等等;有时目的基因比较生僻,针对某物种的抗体尚未上市,这时我们就得进行基因同源性(homology)对比,找出抗原similarity或identity最大的那个抗体。



Tips 3

抗原的修复


有时候我们按照别人的经验买对了抗体,可最后染色时死活得不到阳性结果。这时我们往往需要考虑的一个原因就是抗原表位被封闭或破坏。网上有很多抗原修复的方法,不再一一赘述,这里我只献上我最常用且较简单的方法:


自制10mM pH6.0的柠檬酸钠溶液,将切片放入装有修复液的保鲜碗中,置于微波炉中煮,待溶液煮沸后可调至中小火煮10分钟,重复以上过程2次,如果微波炉自带煮饭功能,那直接选择此按钮即可(整个过程30分钟左右)。


此法极易造成样本脱片,因此文中提到的防脱方法对于解决该问题非常有效。另外一定要选择密封性好的保鲜盒,否则在煮片过程中很容易造成溶液蒸干,继而影响最终的染色效果。


以上这些小Tips伴我度过了五年的读博生涯,顺利毕业,欢迎广大同僚以及目前正奋战在科研台的同仁们效仿借鉴。





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