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科研新技术 Laser Capture Microdissection LCM 激光捕获显微切割

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LCM是利用激光在显微镜下切割单细胞或小簇细胞的一种技术。目的是为获取纯的特异性的细胞用于诊断、预后及科研。

  1.获得纯细胞群的意义

  由Virchow宣称,能代表疾病的基本的单位是细胞而不是组织。如果没有一个可靠的单细胞分离方法就不能进行充分的分析。肿瘤或前肿瘤分子改变的精准分析常常只需要检测感兴趣的细胞。LCM具有精准选择的能力(Fig.1)。


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  Fig.1 (A) Cutaneous malignant melanoma with a prominent central group of melanocytes, as observed under light microscope prior to laser capture microdissection.(B) The central group of melanocytes has been removed without alteration to the adjacent tissue in this image following LCM.(C) An image of the group of isolated melanocytes following extraction.

  2.程序概述

  用显微镜找到感兴趣的细胞区域(Fig.2.A),将带有粘性的热弹力膜的离心管盖直接放置于载玻片上的组织上(Fig.2.B),近红外激光器发射激光通过转移膜及其感兴趣的细胞,转移膜受热并局部融化,并迅速渗入组织空隙(Fig.2.C),转移膜冷却后与所选择的细胞形成聚合物。加热与冷却只在几毫秒内完成,转移膜与细胞的结合力要强于细胞与载玻片的结合力。新聚合物形成后通过收缩与周围组织脱离,转移膜可以移动并获取足够的感兴趣的细胞(Fig.2.D)。当获取细胞完成后,聚合物移入0.5ml离心管,管内盛有裂解液或消化缓冲液(Fig.2.E)。


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  Figure2. Procedural Overview

  3.标本及处理

  标本类型可以为多种:如石蜡包埋标本、冰冻标本、细胞或存档的已经染色并封片的标本。不管是冰冻或是固定的标本均应快速操作以免被内源性RNA酶、核酸酶或蛋白酶所降解。标本固定后切片,厚度在5-10 um,切片组织放在没电荷、无盖玻片的载玻片上,再进行后续的染色如HE染色、IHC染色等等。

  4.系统组成

  系统由以下几个部分组成:LCM光学显微镜(Fig.3)、近红外激光器、电子控制系统(或带控制手柄)的显微镜载物台、相机具有实时显微摄像功能、计算机系统。


  

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  Fig.3A. Leica laser capture microdissection system (LMD6000) (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). B. Artcurus laser capture microdissection system (PixCell) (Arcturus Bioscience Inc., Mountain View, California, USA).

  5.激光及转移膜的主要特点

  膜的成分是由乙烯醋酸乙烯酯组成,厚度为100um,膜的直径是6mm,该膜装在透明管帽内,聚合时容易从标本上撤回(Fig.4)。该膜不会传递热量至邻近的细胞,近红外光与浸透至转移膜内的染料的吸收光谱十分相近。


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  Fig.4. In this close-up of the Arcturus PixCell , the cap can be seen resting on the glass slide (Arcturus Bioscience Inc.,Mountain View, California, USA).

  转移膜下的组织能够在几微秒内达到接近90℃。只有激光量子能够使膜熔解并与其下的细胞粘附、聚合(Fig.5)。激光的直径能够被调整从7.5-30um。激光能获取不同大小的细胞或小簇细胞。


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  Fig.5. The isolated cells are seen adherent to the transfer film in this scanning electron micrograph (Arcturus Bioscience Inc.,Mountain View, California, USA).

  6. LCM细胞分离的优点及局限性:

  6.1优点:耗时短的细胞分离方法;能极其精准的分离单个细胞,不损坏邻近细胞;细胞与膜的粘附紧密、牢固,不会损失细胞;能将细胞移离开其原来环境进行检测;低度进展病变如增生,也能被取样。

  6.2局限性:固定的标本如果脱水不充分或者冰冻组织在空气下暴露时间太长就很难被膜粘起;坚硬的组织如骨组织及软骨组织就不能应用此方法;如果所取的单细胞小于激光直径7.5um就有可能取到邻近的细胞;花费比手工显微切割昂贵;没有被激光照射的膜对细胞产生的非特异的弱引力,新研制的盖/膜系统并没有直接接触细胞便使这种情况的发生降到最低(Fig.6A-B)


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  Fig.6(A). Advanced cap/transfer films use built-in rails to suspend the transfer film just above the tissue. (B). When the film is struck by the laser beam, the transfer film melts and deforms to contact and bond to the underlying tissue (B). This cap minimizes the possibility of contamination by non-specific binding of unintended cells to the transfer film.

  7.LCM的临床应用

  7.1诊断

  区分癌前病变及早期恶性肿瘤、病理上难以区分的病变如膀胱乳头状瘤与膀胱癌确定肿瘤组织起源如转移性肿瘤的组织起源等。

  7.2预后

  预测侵袭性肿瘤的生物学行为、未来的恶性风险评估、预测靶向治疗的效用。

  7.3药物的发现

  作为一个更大的分子数据库,我们可能会找到一些药物作用机制。

  7.4科学研究

  通过检测各种大分子的特征,识别正常、癌前病变和恶性组织的遗传差异,提高了我们对疾病的整体认知,将有助于未来的诊断、预后评估和治疗方式的选择。


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